一(yī)、【circRNA】circRNA簡介（1）
cirrna是非編碼rna中(zhōng)的一(yī)大(dà)類，它由一(yī)種非經典剪接方式——反向剪接(backsplicing)産生(shēng)；當反向剪接發生(shēng)時，下(xià)遊剪接位點與上遊剪接位點共價連接閉合。雖然類病毒不是由反向剪接機制産生(shēng)的，但是它們是40多年前首次發現的環狀rna分(fēn)子。幾年後，通過電(diàn)子顯微鏡在真核細胞系的細胞質組分(fēn)中(zhōng)觀察到circrna。然而當時它們主要被認爲是由異常剪接事件産生(shēng)的“垃圾”，隻有來自性别決定區y（sry）基因的睾丸特異性circrna被認爲可能具有功能（在小(xiǎo)鼠睾丸中(zhōng)）。近年來，高通量rna測序（rna-seq）和circrna特異性生(shēng)物(wù)信息學算法已經在真核生(shēng)物(wù)中(zhōng)鑒定了數千種circrna，包括真菌，原生(shēng)生(shēng)物(wù)，植物(wù)，蠕蟲，魚類，昆蟲和哺乳動物(wù)，并且發現它們具有組織特定的表達模式。
其實以前我(wǒ)們實驗室主要做lncrna，偶爾也做一(yī)些circrna。最近這2年，手頭有幾個關于circrna的項目，所以趁空閑就準備系統學習一(yī)下(xià)circrna的知(zhī)識。
絕大(dà)多數cirrna由已知(zhī)的蛋白(bái)質編碼基因表達，由單個外(wài)顯子或多個外(wài)顯子構成。由線性rna的所有基本類型的可變剪接産生(shēng)的産物(wù)都可以在circrna中(zhōng)發現，而一(yī)些circrna包含的外(wài)顯子在線性轉錄本中(zhōng)卻沒有。盡管缺乏聚腺苷酸化（poly（a））和加帽，但circrna通常定位于細胞質。然而，内部的内含子保留可能導緻産生(shēng)含來自外(wài)顯子和内含子序列的circrna（稱爲exon-intron circrna），并且在經典的剪接過程中(zhōng)内含子套索的脫支失敗可導緻環狀内含子rna（cirna）産生(shēng)；exon-intron circrna和cirnas位于細胞核中(zhōng)，這些circrna通過與u1小(xiǎo)核核糖核蛋白(bái)（snrnp;例如circeif3j和circpaip2）的相互作用或通過正調節rna聚合酶ii介導的轉錄（pol ii）促進其親本基因的轉錄（如ci-ankrd52）。
雖然反向剪接一(yī)般不如線性剪接的效率高，但是circrna具有很高的穩定性，可以以時間調節的方式在特定的細胞類型中(zhōng)累積。這種高穩定性可能是它們共價閉合的環結構保護這些分(fēn)子免受核酸外(wài)切酶介導的降解的結果。盡管circrna通常表達的水平低于其線性對應物(wù)，但對于許多基因而言，circrna是主要的轉錄物(wù)，并且大(dà)多數産生(shēng)circrna的基因座可能存在經典剪接和反向剪接之間的競争。
在動物(wù)中(zhōng)發現，大(dà)量的circrna在神經發生(shēng)過程中(zhōng)被上調，并且一(yī)些circrna在突觸中(zhōng)富集。然而，盡管已經提出了circrna在發育過程中(zhōng)神經元中(zhōng)的許多不同功能和作用機制，但是是否一(yī)般終末分(fēn)化的細胞（例如神經系統中(zhōng)的細胞）更活躍地産生(shēng)circrna，又(yòu)或者由于circrna的高穩定性導緻其在非增殖細胞中(zhōng)累積，還不清楚。與神經組織相比，circrna通常在癌症和其他細胞增殖率高的疾病中(zhōng)下(xià)調，可能是因爲它們在達到穩定水平之前被增殖稀釋。迄今爲止，circrna已經涉及多種人類疾病，包括糖尿病，神經系統疾病，心血管疾病，慢(màn)性炎症性疾病和癌症，并且circrna在衰老期間累積。
模式植物(wù)水稻和拟南(nán)芥轉錄組研究顯示環狀rna廣泛分(fēn)布于植物(wù)中(zhōng)，同時植物(wù)環狀rna與動物(wù)一(yī)樣存在特定的時空表達模式；此外(wài)，植物(wù)環狀rna與動物(wù)相比具有一(yī)些明顯的特征，如非 non-gt/ag 剪切信号的環狀rna大(dà)量存在。
但是從植物(wù)裏面大(dà)多數circrna發表的文章來看，很多都還處在鑒定階段，真正功能研究比較好的例子還很少，比lncrna的研究還滞後。
circrna形成機制
1. 剪切子依賴的生(shēng)物(wù)合成途徑
實驗表明，外(wài)顯子環化效率依賴于外(wài)顯子附近出現的經典剪切位點，通常反向剪切效率要低于同位置的線性轉錄本，這可能是由于剪切子在反向剪切位點位置上的組裝不利于下(xià)遊5'端和3'端的連接（1a），但是這些剪切子如何參與該過程并不明确。
2. 順式作用元件促進的生(shēng)物(wù)合成途徑
大(dà)多數的circrna包含2、3個外(wài)顯子，這看似除了剪切位點以外(wài)沒有特定的外(wài)顯子序列用于反向剪切；此外(wài)，同一(yī)個基因通過可變剪切能夠産生(shēng)多個circrna（1b）,但是需要注意的是反向剪切可能對外(wài)顯子的最小(xiǎo)長度有限制。在這些過程中(zhōng)，環化的外(wài)顯子側翼内含子中(zhōng)頻(pín)繁的出現調控元件，例如形成 rna雙鏈結構 将顯著增強反向剪切（1b），反向剪切的效率還受到側翼内含子或包含在内的内含子序列與rna配對過程競争的影響（1c）。另外(wài)，内含子序列中(zhōng)短的順式作用元件能夠識别rna結合蛋白(bái)（ pbr s）從而促進外(wài)顯子環化。
3. rna結合蛋白(bái)介導的調控合成途徑
除了順式作用元件，實驗表明，過表達 rbps 或者在側翼内含子序列中(zhōng)添加rna蛋白(bái)結合位點能夠促進circrna的表達，例如mbl（1d）、qki（1e）。同樣也存在抑止circrna表達的蛋白(bái)adenosine deaminase 1 acting on rna (adar1)，主要通過adenosine-to-inosine(a-to-i) 編輯途徑減少互補配對、破壞rna pairs來減少反向加剪切過程（1f）。最近的研究表明，黑腹果蠅laccase2基因反向剪接過程受内含子重複片段、多種hnrnp（異質核核糖核蛋白(bái)（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein））和sr（ser / arg）蛋白(bái)共同調控。
circrna的調控功能
1. mirna海綿
實驗表明，在細胞質中(zhōng)circrna以競争性的結合mirna的方式來調控基因表達。支撐這個模型最好的例子就是cirs-7 (circular rna sponge for mir-7)，cirs-7由人類和小(xiǎo)鼠大(dà)腦中(zhōng)cerebellardegeneration related 1 (cdr1);基因轉錄而來(2a)，包含超過60個mir-7結合位點。通用在小(xiǎo)鼠中(zhōng)，sex-determining region y (circsry); 包含16個mir-138。但是在研究中(zhōng)人和小(xiǎo)鼠circrna中(zhōng)隻有很小(xiǎo)的一(yī)部分(fēn)包含mirna靶位點，這指出大(dà)多數circrna可能不起mirna海綿的作用。
2. 調控轉錄
雖然大(dà)多數circrna定位于細胞質中(zhōng)，但是包含内含子的circrna更可能被限制在人體(tǐ)細胞的細胞核中(zhōng)發揮作用，例如circular intronic rnas (cirnas)通過與延長的pol ii複合物(wù)相互作用促進轉錄過程(2b)，或者exon–introncircrnas (eicirnas能夠與u1 snrnp (small nuclear ribonucleoprotein) 、編碼基因的啓動子相互互作調控轉錄(2c)。
3. 影響剪切過程
circrna通常來自蛋白(bái)質編碼基因的中(zhōng)間外(wài)顯子。因此，circrna的加工(gōng)可能影響前體(tǐ)mrna的可變剪接，可能導緻基因表達及環化的外(wài)顯子改變(2d)。外(wài)顯子跳躍是人前mrna中(zhōng)最常見的可變剪接事件，在理論上，circrna形成應當與線性mrna中(zhōng)的外(wài)顯子跳躍正相關(2d)，然而，并非所有跳過的外(wài)顯子都能産生(shēng)circrnas，這表明其他調節因子可能會影響外(wài)顯子跳躍後的外(wài)顯子環化過程。
二、如何做環狀RNA的功能驗證
随着去(qù)除核糖體(tǐ)測序技術深入發展，越來越多的環狀rna（circrna）不斷報道發現，基于生(shēng)物(wù)信息學分(fēn)析顯示circrna發揮着極其重要的生(shēng)物(wù)學功能。然後如何采用實驗手段進一(yī)步驗證circrna的生(shēng)物(wù)學功能顯得尤爲重要，本文帶大(dà)家一(yī)起探讨circrna功能驗證策略。
1. circrna定量驗證
circrna定量驗證手段與常規pcr手段不同，常規手段是圍繞目的片段的上下(xià)遊分(fēn)别設計pcr引物(wù)，稱之爲convergent primer，需擴增的片段位于上下(xià)遊引物(wù)之間（如圖1.1）。而對于circrna，尤其外(wài)顯子環化circrna，除backsplice junction位點處不同于linear rna之外(wài)，body區與linearrna是一(yī)緻的。因此，驗證時需要特異性針對backsplice junction位點處設計primer，稱之爲divergent primer（如圖1.1），而且設計的pcr product的長度越短越好，可以增強backsplice junction位點處擴增效率。
圖1.1 convergent primer vs divergent primer
爲增強circrna的驗證效率，起始模版需滿足以下(xià)要求（3 free）：1. dna free；2. rrna free；3. linearrna free。
驗證策略：對3free rna以及genome dna同時進行pcr擴增，電(diàn)泳檢測pcr product大(dà)小(xiǎo)（如圖1.2）。
圖1.2 circrna引物(wù)擴增結果
2. circrna northern blot驗證
northern blot方法是一(yī)種比較古老但行之有效的序列驗證方法，需圍繞circrna設計探針序列，而探針序列設計是驗證成功至關重要的環節。對于circrna探針設計，我(wǒ)們建議以下(xià)兩點：1. 對于外(wài)顯子環化circrna，建議探針盡可能跨backsplice junction位點；2.對内含子環化circrna，可圍繞内含子區域設計探針。
驗證策略：對3 free rna、total rna以及genome dna同時進行雜(zá)交驗證。
3. circrna過表達
circrna過表達思想主要源于circrna生(shēng)物(wù)形成機制，已有多篇文章報道circrna成環機制，目前比較公認的成環機制爲circrna側翼序列的堿基互補配對，稱之爲alu結構（如圖2）。
圖2 circrna側翼結構特征
基于circrna側翼alu序列特征，pcr擴增含側翼alu序列的目标dna序列，随後依據對應限制性内切酶位點進行酶切，進而連接pegfp-c1載體(tǐ)。連接載體(tǐ)進而轉染對應細胞樣本，定量pcr檢測轉染效率。基于divergent primer驗證circrna過表達倍數。
過表達策略：1. 擴增目标區域包含circrna側翼alu序列或内部堿基互補序列，側翼上下(xià)遊1kb處過表達效率更佳；2. 目标區域擴增基于基因組dna爲模版。
4. circrna敲除
circrna敲除思路主要針對circrna backsplice junction處序列信息設計sirna，對于内含子環化circrna，也可針對内含子區域設計相應sirna進行幹擾。divergent primer驗證circrna敲除倍數。
敲除策略：
1. 外(wài)顯子環化circrna，針對backsplice junction位點前後序列設計sirna，如圖3所示；
2. 内含子環化circrna，除針對backsplice junction位點前後序列設計sirna序列以外(wài)，也可針對内含子區域序列設計sirna。
3. 每個sirna設計對應的對照，backsplice junction位點一(yī)端互補配對，另一(yī)端錯配，如圖3所示。
三、熱點綜述 | circRNA在癌症和腫瘤學中(zhōng)的新作用
在過去(qù)的十年中(zhōng)，環狀rna (circrnas)作爲一(yī)大(dà)類主要是非編碼rna分(fēn)子出現，通過不同的作用機制在癌症的發生(shēng)和發展中(zhōng)發揮關鍵作用。此前，《 nature reviews clinical oncology 》發表了題爲“the emerging roles of circrnas in cancer and oncology”的綜述文章， 回顧了目前關于circrna在癌症中(zhōng)的生(shēng)物(wù)發生(shēng)、調節和功能的知(zhī)識，以及它們作爲生(shēng)物(wù)标記物(wù)、治療劑和藥物(wù)靶點的臨床潛力。
circrna的生(shēng)物(wù)生(shēng)成依賴于典型的剪接體(tǐ)機制，但其效率遠遠低于常規的線性剪接。然而，一(yī)旦circrnas形成，它們就特别穩定，并能在細胞質中(zhōng)積累。
典型rna剪接通過内含子将上遊5′剪接位點（剪接供體(tǐ)）連接到下(xià)遊3′剪接位點（剪接受體(tǐ)），導緻相鄰外(wài)顯子之間的内含子被移除。然而，許多前mrna可以進行反剪接，即下(xià)遊剪接供體(tǐ)與上遊剪接受體(tǐ)相連接，跨越一(yī)個或多個外(wài)顯子，産生(shēng)一(yī)個共價封閉的circrna。對于許多基因來說，前mrna的線性剪接和反剪接之間會發生(shēng)競争，有幾個因素會影響這兩種剪接方式的平衡。在癌症中(zhōng)，這種平衡經常被破壞，導緻circrna的表達失調。
反向剪接需要在下(xià)遊剪接供體(tǐ)和上遊剪接受體(tǐ)位點兩側的内含子上繞圈，使這些剪接位點接近，并産生(shēng)外(wài)顯子circrnas（ecircrnas）；或者，如果内含子保留在環中(zhōng)，則産生(shēng)外(wài)顯子-内含子環狀rna（eicirnas）。反向内含子重複序列（如alu元件）、非重複互補序列或rna結合蛋白(bái)（rbps）的二聚化可促進環狀結構的形成。
一(yī)種新型的circrnas，即readthrough circrnas，是通過轉錄終止的失敗而産生(shēng)的，轉錄本由此延伸到下(xià)遊基因并随後反向擴增。因此，circrna可以包含來自相鄰基因的外(wài)顯子。轉錄終止的整體(tǐ)效率已被證明在癌症中(zhōng)發生(shēng)了改變，這增加了readthrough circrnas影響疾病表型的可能性。
由于易位連接上遊和下(xià)遊内含子中(zhōng)互補序列的并置，染色體(tǐ)易位可導緻融合circrnas（f-circrnas），這可能獨立于其融合蛋白(bái)對應物(wù)而促進癌症的發展。與緻癌融合蛋白(bái)結合，f-circrna甚至可以促進體(tǐ)内白(bái)血病的進展。
此外(wài)，circrna可以通過其宿主基因啓動子的超甲基化或改變組蛋白(bái)修飾而經曆癌症特異性轉錄沉默。
ecircrnas主要定位于細胞質，而eicirnas和cirnas通常保留在細胞核中(zhōng)。circrnas如何從細胞核中(zhōng)輸出尚不完全清楚，但atp依賴的rna螺旋酶ddx39a和剪接體(tǐ)rna螺旋酶ddx39b已被證明參與這一(yī)過程，其方式取決于circrna的長度。此外(wài)，n6-甲基腺苷（m6a）修飾經常出現在circrna中(zhōng)，并被證明會影響其出核。
circrna對線性rna降解機制有抵抗力，circrna降解的機制尚待完全闡明。例如cirs-7（也稱爲cdr1as），可以通過依賴于特定mirna的高度互補結合位點mir-671的方式降解，該位點可以觸發argonaute 2（ago2）對産生(shēng)的雙鏈rna雙鏈體(tǐ)的切割，argonaute 2是rna誘導沉默複合物(wù)的關鍵成分(fēn)。在一(yī)個更全面的層面上，核内核糖核酸酶與circrna降解有關。此外(wài)，高度結構化的circrnaa可能會受到atp依賴性解旋酶upf1和g3bp1介導的降解，其降解方式可能取決于g3bp1固有的内切核酸酶活性。
circrna發揮其功能從而影響癌症發生(shēng)和發展的機制多種多樣。circrna的序列和穩定性、轉錄後修飾、二級結構以及它們的積累方式和定位決定了它們的功能。
microrna sponging 。 位于細胞質中(zhōng)的circrnas可以通過對mirnas的海綿化作用參與轉錄後的基因調控，從而阻止特定的mirnas與靶mrnas相互作用并抑制它們。最好的mirna海綿候選者cirs-7含有超過60個mir-7結合位點，可能在某些組織中(zhōng)作爲競争性内源性rna（cerna）發揮作用。然而，cirs-7在癌細胞中(zhōng)作爲cerna發揮作用的觀點受到了挑戰，在推斷circrna的mirna海綿特性時，應考慮該領域的一(yī)些争議。circhipk3是另一(yī)個具有潛在海棉特性的circrna的例子，它可能結合幾種不同的mirna，包括抑制腫瘤的mir-124，沉默這種circrna可以抑制細胞生(shēng)長。
蛋白(bái)質相互作用 。 一(yī)些circrnas可以與rbp相互作用，起到蛋白(bái)質海綿或抑制劑的作用，可以作爲支架使不同的蛋白(bái)質接近，或者可以将蛋白(bái)質招募到特定的亞細胞隔室。例如一(yī)種在hela細胞中(zhōng)具有蛋白(bái)質海綿特性的circrna，即circpabpn1，它與線性 pabpn1 mrna競争結合elav1（也稱爲hur），從而抑制pabpn1翻譯。
circrna的翻譯 。檢測circrna衍生(shēng)肽或蛋白(bái)質的實驗存在許多缺陷，因此應仔細設計。作爲一(yī)個類别，circrnas通常被認爲是非編碼的；然而，包括circ-znf609和circmbl在内的特定circrna含有内部核糖體(tǐ)進入位點（ires），可以進行不依賴于cap的翻譯，而包括circarhgap35在内的其他circrna可以進行m6a依賴翻譯。一(yī)些circrna，包括一(yī)個來源于e-鈣粘蛋白(bái)基因（cdh1）的circrna（命名爲circ-e-cad），編碼在癌症中(zhōng)具有潛在功能相關性的獨特肽，本綜述稍後将進一(yī)步讨論。circrna還可以編碼與癌症功能相關的較大(dà)蛋白(bái)質（如circarhgap35和circmapk1産生(shēng)的緻癌蛋白(bái)質）。此外(wài)，來源于病毒的circrna可以被翻譯，如來源于人乳頭瘤病毒的circe7，其在宮頸癌和頭頸癌中(zhōng)大(dà)量表達并具有緻癌活性。
circrna主要是在疾病背景下(xià)研究的，但越來越多的證據也表明在正常生(shēng)理條件下(xià)具有重要功能。在這裏，我(wǒ)們關注與癌症相關的細胞内穩态過程。有趣的是， 多項研究指出了特定circrna在維持胚胎和成人幹細胞的幹細胞和多能幹細胞中(zhōng)的關鍵作用，而其他研究表明circrna是幹細胞分(fēn)化和組織發育、維持和恢複的重要決定因素。
在緻癌轉化過程中(zhōng)，經常觀察到從頭獲得的幹細胞和發育基因表達程序，由此産生(shēng)的細胞具有無限的自我(wǒ)更新潛力。因此 circrna包括上面描述的那些作用，有望在解除管制時在癌症發展中(zhōng)發揮作用。 例如，circ-znf609已在癌症中(zhōng)被廣泛研究，并顯示通過增強肝癌細胞的幹性促進肝癌的發生(shēng)。在機制上，circ-znf609通過分(fēn)泌mir-15a-5p和mir-15b-5p激活hcc細胞中(zhōng)的hedgehog信号，其參與hedgehog信号通路轉錄因子gli2的轉錄後沉默。circzkscan1和circephb4是另外(wài)兩個分(fēn)别調節肝癌和膠質瘤中(zhōng)腫瘤幹細胞特性的circrna的例子。此外(wài)，來源于e-鈣粘蛋白(bái)前體(tǐ)mrna的circ-e-cad編碼肽c-e-cad，與egfr相互作用并激活下(xià)遊stat3信号，從而促進癌細胞增殖、存活和侵襲，從而有助于維持膠質母細胞瘤中(zhōng)的癌幹細胞狀态。源自緻癌病毒的circrnas也可能誘發癌症幹細胞的特性，如胃癌中(zhōng)epstein-barr病毒衍生(shēng)的circlmp2a就是一(yī)個例子。
除了癌細胞幹性之外(wài)，在所有常見的癌症類型和許多罕見的惡性腫瘤中(zhōng)都觀察到廣泛的circrna表達失調，在快速增殖的癌細胞中(zhōng)circrna水平通常降低。
調控細胞周期的circrna。 已發現許多單獨的環狀rna促進細胞周期進展。研究者們發現許多circrna是細胞增殖所必需的，包括circhipk3和circklhl，對于這些circrnas，用短發夾rna介導的敲除法也觀察到了類似的表型。對circfam120a進一(yī)步的機制分(fēn)析，發現這種circrna通過競争性地與igf2bp2（一(yī)種翻譯抑制劑）結合，促進了來自其宿主基因fam120a（一(yī)種參與akt信号通路的腫瘤基因）的mrna的有效翻譯，盡管circrna的含量比mrna少。這一(yī)發現意味着igf2bp2優先與circrna轉錄物(wù)結合，而circfam120a的m6a修飾被證明是其增強igf2bp2結合能力的原因。與fam120a一(yī)樣，mapk1是一(yī)個直接參與信号轉導的緻癌基因，導緻細胞增殖。在肺鱗癌中(zhōng)，源自tp63基因的circrna的上調，circtp63也能促進細胞增殖。circ-znf609還通過調節g1/s轉換直接參與細胞周期。circpvt1來自非編碼的pvt1基因座，是另一(yī)個在癌症中(zhōng)被廣泛研究的circrna，大(dà)多數研究表明其緻癌活性是通過增強細胞周期的進展。
circrna與細胞凋亡或自噬。 盡管獲得了大(dà)量的遺傳和表觀遺傳畸變，避免細胞凋亡是癌細胞繼續增殖的關鍵--因此也是腫瘤生(shēng)長的關鍵。許多單獨的circrnas已經被證明可以通過抑制或誘導細胞凋亡來發揮作用。後者的一(yī)個例子是circ-foxo3，它與mdm2結合并阻止其與foxo3相互作用，從而抑制其宿主基因的蛋白(bái)體(tǐ)産物(wù)的泛素介導的蛋白(bái)體(tǐ)降解。自噬是另一(yī)個在癌症中(zhōng)起重要作用的過程，已證明可促進自噬的circrna實例包括卵巢癌和乳腺癌中(zhōng)的circrab11fip1和circr-dnmt1。
參與血管生(shēng)成的circrna。 血管生(shēng)成是癌細胞進入血管系統并随後轉移的關鍵。在膀胱癌中(zhōng)，circhipk3的下(xià)調與侵襲性腫瘤表型和不利的臨床結果有關，可能反映了這種circrna在血管生(shēng)成和轉移中(zhōng)的抑制作用。circhipk3已被證明能海綿化mir-558，鑒于它與啓動子區域結合并上調hpse的轉錄，其具有mirna的非經典功能。hpse編碼肝素酶，這是一(yī)種内切糖苷酶，可裂解細胞表面和細胞外(wài)基質硫酸肝素蛋白(bái)多糖，導緻血管内皮生(shēng)長因子（vegf）和基質金屬蛋白(bái)酶9（mmp9）的釋放(fàng)，兩者都是重要的促血管生(shēng)成因素。circsmarca5是抑制血管生(shēng)成的circrna的另一(yī)個例子。相反，circrna可以誘導血管生(shēng)成，例如circ-ccac1在膽管癌中(zhōng)的應用和circpok在肉瘤中(zhōng)的應用。
circrna與無限增殖。 保護染色體(tǐ)末端的端粒對于癌細胞無限增殖的能力至關重要，一(yī)些circrna被認爲可以影響端粒酶的活性，包括circmeg3和circwhsc1。
circrna與細胞能量。 癌細胞需要重新規劃它們的能量代謝，以便在氧氣和葡萄糖供應的波動條件下(xià)不斷爲細胞的生(shēng)長和分(fēn)裂提供能量。α-烯醇化酶由eno1編碼，是一(yī)種重要的糖酵解酶，有助于癌症的進展。有趣的是，該基因還産生(shēng)一(yī)種circrna：circ-eno1，已被證明通過分(fēn)泌mir-22-3p促進糖酵解和肺腺癌的進展，導緻其線性mrna對應物(wù)的上調。而circatp2b1則是促進糖酵解的另一(yī)個例子。
circrna和腫瘤免疫監測。 免疫系統協調各種保護性反應以對抗腫瘤的發展，内源性circrna通過結合和抑制蛋白(bái)激酶r（pkr）參與抑制先天性免疫反應。核酸傳感器rig-i也可以檢測到外(wài)源（但不是内源性）circrna，它誘導i型和iii型幹擾素應答。circndufb2通過破壞其解旋酶和card結構域之間的分(fēn)子内相互作用來激活rig-i，從而增強了rig-i和線粒體(tǐ)抗病毒信号蛋白(bái)（mavs）之間的相互作用，從而增強了nsclc細胞的免疫原性。來自小(xiǎo)鼠模型的數據證實了這些發現。
circrna在侵襲和轉移中(zhōng)的作用。 癌細胞的轉移擴散是癌症最緻命的方面。emt是腺癌進展的關鍵過程之一(yī)，并已被證明其由若幹circrna和circrna生(shēng)物(wù)發生(shēng)因子促進。其他已被證明促進轉移的circrna包括分(fēn)别來自小(xiǎo)細胞肺癌和非小(xiǎo)細胞肺癌中(zhōng)fli1（fecr）和eml4–alk融合基因（f-circea-2a）的circrna。
circrna通常以組織特異性甚至細胞類型特異性的方式表達。此外(wài)，許多單個的circrna在腫瘤中(zhōng)相對于相鄰非惡性組織有差異表達，并與某些臨床特征相關，如腫瘤大(dà)小(xiǎo)、組織學分(fēn)級、淋巴結、轉移（tnm）分(fēn)期等。這些發現突出了circrna作爲有前途的診斷和預後生(shēng)物(wù)标記物(wù)的重要性，其在生(shēng)物(wù)流體(tǐ)（如血漿、唾液和尿液）中(zhōng)的高穩定性和可檢測性進一(yī)步證實了這一(yī)點。
circrna作爲預後生(shēng)物(wù)标志(zhì)物(wù)。 cirs-7被認爲是通過在癌細胞中(zhōng)海綿化mir-7而發揮癌基因的功能，并與大(dà)多數癌症類型的預後不良有關。然而，2020年公布的數據顯示，經典癌基因驅動型腺癌的癌細胞中(zhōng)完全沒有這種circrna。雖然這些發現似乎相互矛盾，但cirs-7在位于這些腫瘤内的基質細胞中(zhōng)非常豐富，并且在包括結腸、乳腺和肺在内的多種腺癌中(zhōng)，高比例的基質細胞是一(yī)個強有力的獨立預後因素。在一(yī)些研究中(zhōng)被認爲是預後生(shēng)物(wù)标志(zhì)物(wù)的其他circrnas包括circubap2和circlarp4。盡管circrna的 panels或signatures被證明可能是更可靠的生(shēng)物(wù)标志(zhì)物(wù)，但是單獨的circrna也可能具有預後價值。
circrna作爲診斷生(shēng)物(wù)标記物(wù) 。有證據表明circrna具有區分(fēn)癌症亞型的潛力，這通常有助于指導治療決策。例如，在非小(xiǎo)細胞肺癌中(zhōng)，circacvr2a的低表達和circccnb1的高表達可能分(fēn)别有助于區分(fēn)腺癌和鱗狀細胞癌。此外(wài)，circrnas也可以被非侵入性地檢測，并可能被用于診斷。
circrna作爲預測性生(shēng)物(wù)标記物(wù)。 通過預測對治療的反應，circrna可以幫助臨床醫生(shēng)在限制毒性的同時實現最佳患者結局。例如在乳腺癌和前列腺癌中(zhōng)，可以通過測量特定circrna的表達水平來預測内分(fēn)泌治療反應。circrna的表達水平也可能有助于預測對各種化療藥物(wù)的反應。例如，在鼻咽癌患者中(zhōng)，基于circcrim1表達和n分(fēn)期，可以預測對含多西紫杉醇的誘導化療的不同反應。此外(wài)，臨床前研究表明，circrna也在免疫治療抵抗中(zhōng)發揮作用。circrna還可能用于預測未來治療的不良反應，有數據表明circrna作爲各種毒性的保護劑或介導劑的功能作用。
用于早期檢測的circrna。 鑒于大(dà)多數癌症一(yī)旦轉移就無法治愈，早期癌症檢測是降低發病率和死亡率的關鍵。由于其高穩定性和組織特異性表達，circrna作爲早期癌症檢測的微創生(shēng)物(wù)标記物(wù)具有巨大(dà)潛力。一(yī)項多中(zhōng)心研究的數據表明，基于血漿的circrna生(shēng)物(wù)标記物(wù)在早期檢測hcc方面表現良好，在區分(fēn)hbv相關hcc患者與非hcc患者方面的準确性高于甲胎蛋白(bái)。circrna也被證明富含血清外(wài)小(xiǎo)體(tǐ)，并具有早期診斷結直腸癌的潛力，而另一(yī)項研究顯示，來自血清細胞外(wài)小(xiǎo)泡的兩種circrna，circhipk3和circsmarca5,，在膠質母細胞瘤的早期診斷中(zhōng)具有強大(dà)的潛力。
circrna功能喪失療法 。circrna在腫瘤發生(shēng)中(zhōng)的既定功能作用将其确定爲抗癌治療的明顯靶點。使用反義技術可以選擇性地抑制或降解緻癌的circrna。一(yī)種選擇是使用crispr–cas9系統，但是涉及倫理及不可預測的選擇性剪接事件風險；可以選擇rna幹擾、crispr–cas13系統等更常見的方式進行。目前爲止，大(dà)多數功能缺失的研究都是在臨床前動物(wù)模型中(zhōng)使用rnai進行circrna敲除，并且還沒有circrna靶向治療進入臨床試驗。
circrna功能獲得療法 。 新的癌症治療也可能基于circrna功能的獲得，或者通過天然腫瘤抑制因子circrna的過度表達，或者通過含有腫瘤抑制因子的人工(gōng)circrna的表達。在臨床前研究中(zhōng)，最常見的方法是提供含有重複mirna結合位點的circrna，它可以作爲緻癌mirna的cernas。此外(wài)，circrna所發揮的治療作用并不局限于rna元素，還可以是蛋白(bái)質。
鑒于大(dà)多數circrna的表達水平非常低，并且可能是非功能性的， 未來的研究應更關注研究中(zhōng)circrna的豐度。 此外(wài)，作者鼓勵旨在 解決作用機制和病理生(shēng)理作用的研究。 考慮到m6a修飾已被證明能增強某些circrna的蛋白(bái)質吸附和翻譯潛能， 研究circrna轉錄後化學修飾的功能相關性也将很重要 。
盡管circrnas在癌症中(zhōng)的作用機制和病理生(shēng)理作用存在争議，但這些分(fēn)子作爲診斷、預後和預測性生(shēng)物(wù)标記物(wù)仍具有特殊的前景。
目前circrna表達譜僅在有限數量的癌症實體(tǐ)中(zhōng)得到全面分(fēn)析，而 circrna表達譜與驅動癌基因突變之間的關系 通常知(zhī)之甚少。此外(wài)，由于技術挑戰，缺乏 單細胞水平和空間分(fēn)辨率的circrna表達數據 。這些研究對于理解circrna的功能以及推動未來生(shēng)物(wù)标記物(wù)的發現和發展至關重要。
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參考文獻
kristensen l s, jakobsen t, hager h, et al. the emerging roles of circrnas in cancer and oncology[j]. nature reviews clinical oncology, 2021: 1-19.
